Die Gemeinde Pfaffstätten liegt an der Thermenlinie in Niederösterreich, an der östlichen Grenze des Biosphärenparks. Hier gehen die Hügel des Wienerwaldes sanft in die Ebene des Wiener Beckens über. Die Ausläufer der Alpen treffen auf den relativ trockenen, pannonischen Raum. Solche klimatischen und landschaftlichen Grenzen sind besonders artenreich und so gehört die Thermenlinie zu den „Hot Spots“ der Artenvielfalt im Biosphärenpark Wienerwald und ist eines der artenreichsten Gebiete in ganz Österreich.
In Pfaffstätten gibt es eine Vielzahl an Lebensräumen. Schwarzföhrenwälder, Eichen-Hainbuchenwälder und Buchenwälder gehen noch auf den Hügeln in ein Mosaik aus Trockenrasen, Flaumeichenwald und strukturreichen Weingärten über. In der Ebene wird die Kulturlandschaft von den Weingärten geprägt. Der Wiener Neustädter Kanal ist die Heimat zahlreichen Wasserlebewesen. Sogar zwei Höhlen gibt es in Pfaffstätten.
In den besonders schützenswerten Trockenrasen leben hunderte Pflanzen- und tausende Tierarten. Das Naturschutzgebiet Glaslauterriegel-Heferlberg war ein Standort des großen LIFE-Projektes „Pannonische Steppen- und Trockenrasen“. Hier wurden bereits mehr als 1180 Schmetterlingsarten nachgewiesen. Das ist fast ein Drittel der in Österreich vorkommenden Schmetterlingsarten! Auch der Biosphärenpark Wienerwald unterstützt die Schutzmaßnahmen über das Projekt Weinbaulandschaften.
Steirischer Fanghaft, Brunners Schönschrecke, Sägeschrecke, Kantabrische Winde, Dalmatinische Lotwurz und viele mehr gehören zu den ganz großen Raritäten in Österreich.